丽江乐投letou生物报路:慢性胰腺炎（chronic pancreatitis）是各类病因引起胰腺组织和职能产生不成逆扭转的慢性炎症性疾病。。。。。。它的产生通常是由与消化蛋白酶或其抑造剂有关的遗传成分决定的。。。。。。PRSS1、SPINK1和CTRC等基因的突变会扭转胰蛋白酶水平和胰腺炎风险。。。。。。

沉要的是，，，，，慢性胰腺炎的遗传风险也能够通过与胰蛋白酶活性无关的机造来介导，，，，，如一些PRSS1突变对胰蛋白酶活性没有影响，，，，，但会导致酶谬误折叠，，，，，引发内质网（ER）应激。。。。。。同样地，，，，，CPA1（羧肽酶A1）突变也在体表引起酶谬误折叠，，，，，导致CPA1细胞内滞留和降解以及有关的ER应激。。。。。。

只管体表观察到的了局支持突变诱导的谬误折叠和ER应激，，，，，但一向不足适当动物模型的证据，，，，，而CPA1突变的致病机造也是如果的。。。。。。这限度了钻研人员对疾病机造的相识，，，，，也故障了新型疗法的临床前试验。。。。。。

为此，，，，，美国波士顿大学的钻研人员成立了一个新型的幼鼠基因敲入品系，，，，，在幼鼠Cpa1基因座上携带人CPA1突变p.N256K。。。。。。通过对这种幼鼠品系的钻研，，，，，他们证实，，，，，CPA1突变导致酶谬误折叠，，，，，并通过ER应激的机造引起慢性胰腺炎。。。。。。这项沉要的成就颁发在消化路领域的顶尖杂志《Gut》上，，，，，影响因子达17.016。。。。。。

这项钻研的沉要意思在于，，，，，这是第一个与消化酶谬误折叠和ER应激有关的慢性胰腺炎幼鼠模型。。。。。。它出格适合测试各类环境成分（如酒精、吸烟、高脂饮食）或药物对慢性胰腺炎产生和发展的影响。。。。。。

本文也提供了一个钻研新思路，，，，，对于一些体表尝试已有结论但还不足活体尝试证实的基因变异疾病。。。。。，，通过构建携带变异的幼鼠模型来进行活体钻研不失为一种可行的步骤。。。。。。

在这项钻研中，，，，，波士顿大学的Miklós Sahin-Tóth和Eszter Hegyi委托赛业生物（Cyagen）通过C57BL/6胚胎干细胞的同源沉组将人CPA1突变p.N256K敲入幼鼠的Cpa1基因座，，，，，造备出CPA1点突变幼鼠（CPA1 N256K品系）。。。。。。同时，，，，，他们还造备出CPA1 null品系，，，，，由于新霉素（neo）表白框的存在导致Cpa1 mRNA和CPA1蛋白表白水平降低。。。。。。此品系可作为对照，，，，，以分辨CPA1蛋白活性失落或CPA1谬误折叠。。。。。。

为了鉴定CPA1 N256K和CPA1 null幼鼠品系胰腺中Cpa1 mRNA的表白，，，，，钻研人员从1月龄的动物中造备胰腺cDNA。。。。。。定量PCR的分析了局批注，，，，，与C57BL/6N对拍照比，，，，，CPA1 N256K品系的Cpa1 mRNA表白降低了30%，，，，，而CPA1 null品系则降低了95%。。。。。。Western blot分析也批注，，，，，CPA1 N256K品系的CPA1蛋白含量虽降低但依然显著，，，，，而CPA1 null品系则检测不到CPA1蛋白的表白（图1）。。。。。。

图1. CPA1 N256K幼鼠的造备和突变等位基因的表白。。。。。。(A) 通过同源沉组步骤造备出CPA1 null和CPA1 N256K品系。。。。。。(B) 通过定量PCR检测1月龄的CPA1 N256K、CPA1 null和C57BL/6N对照幼鼠胰腺中Cpa1 mRNA的表白。。。。。。(C) 通过western blot分析CPA1 N256K、CPA1 null和C57BL/6N对照幼鼠胰腺中的CPA1蛋白表白。。。。。。

之后，，，，，他们从6周龄的CPA1 N256K和C57BL/6N对照幼鼠中分离胰腺腺泡，，，，，并测定CPA1向造就基中的排泄。。。。。。与野生型的CPA1蛋白相比，，，，，CPA1 p.N256K突变体的排泄险些检测不到。。。。。。相比之下，，，，，腺泡细胞裂解液的western blot分析显示了高水平的CPA1突变蛋白，，，，，批注突变蛋白滞留在细胞内（图2）。。。。。。同时，，，，，他们也把稳到N256K品系的细胞内CPA1蛋白水平略低于对照，，，，，批注一些谬误折叠和滞留的突变蛋白被降解。。。。。。

图2. CPA1 N256K和C57BL/6N对照幼鼠的腺泡细胞排泄的CPA1蛋白（自觉或雨蛙素诱导）。。。。。。(A) 增长或未增长30 pM雨蛙素孵育60分钟后，，，，，排泄到造就基中的CPA1。。。。。。(B) 增长或未增长30 pM雨蛙素孵育60分钟后，，，，，细胞裂解液中的CPA1含量。。。。。。

钻研人员发现，，，，，两种新的CPA1品系都没有阐发出显著的表型扭转，，，，，并且正常滋生。。。。。。CPA1 null幼鼠和C57BL/6N对照幼鼠的胰腺状态类似。。。。。。相比之下，，，，，CPA1 N256K幼鼠从3月龄起就被观察到胰腺偏幼。。。。。。沉量测定证实了CPA1 N256K品系的胰腺出现萎缩。。。。。。为了鉴定胰腺萎缩的组织学变动，，，，，他们对1、3、6和12月龄的幼鼠胰腺切片进行染色，，，，，并将它们与对应的CPA1 null 和C57BL/6N切片进行比力。。。。。。

对于CPA1 N256K突变幼鼠，，，，，钻研人员观察到慢性胰腺炎的标志，，，，，蕴含腺泡细胞萎缩和炎性细胞浸润。。。。。。Masson三色染色法进一步证实了这一结论，，，，，它揭示了CPA1 N256K幼鼠腺泡中的宽泛纤维化。。。。。。通过细胞角蛋白19和Sox9的免疫组化染色，，，，，他们还观察到腺泡-导管化生（假管复合物）。。。。。。相比之下，，，，，CPA1 null对照组未阐发出胰腺疾病的迹象，，，，，与C57BL/6N对照幼鼠类似（图3）。。。。。。

图3. CPA1 N256K幼鼠的纤维化和腺泡-导管化生。。。。。。(A) Masson三色染色法显示CPA1 N256K幼鼠的腺泡周围存在宽泛的纤维化（蓝色）。。。。。。(B) CPA1 N256K幼鼠胰腺中的羟脯氨酸含量相对于CPA1 null幼鼠和C57BL/6N对照增长。。。。。。(C) CK19和Sox9的免疫组化了局显示CPA1 N256K幼鼠存在宽泛的腺泡-导管化生，，，，，而CPA1 null幼鼠没佑祝。。。。。

最后，，，，，为了确定CPA1 N256K品系的组织学变动是否与ER应激标志物升高有关，，，，，钻研人员别离测定了1月龄、3月龄和12月龄幼鼠的伴侣蛋白Hspa5（BiP）和转录因子Ddit3（CHOP）。。。。。。与C57BL/6N和CPA1 null对拍照比，，，，，CPA1 N256K幼鼠的BiP阐发出一致但适度的上调，，，，，而CHOP在所有功夫点阐发出显著的上调（图4）。。。。。。

图4. CPA1 N256K幼鼠、CPA1 null幼鼠和C57BL/6N对照幼鼠的内质网应激标志物Hspa5和Ddit3的表白，，，，，A、B和C别离对应1月龄、3月龄和12月龄。。。。。。对胰腺cDNA样本进行定量PCR，，，，，了局暗示为相对于C57BL / 6N了局均匀值的倍数变动。。。。。。

CPA1 N256K基因敲入幼鼠上的一系列尝试批注，，，，，CPA1突变p.N256K导致酶谬误折叠，，，，，并引发慢性胰腺炎，，，，，同时陪伴着ER应激有关的促凋亡转录因子CHOP的上调。。。。。。CPA1 null幼鼠并没有观察到这些病理景象，，，，，批注CPA1职能失落自身并不引起腺泡细胞危险。。。。。。谬误折叠依赖性的通路在慢性胰腺炎中阐扬致病作用，，，，，这也为针对ER应激有关机造的医治过问打下基础。。。。。。

钻研人员强调，，，，，这种谬误折叠诱导的慢性胰腺炎新模型有望在临床前钻研中阐扬作用。。。。。。CPA1 N256K幼鼠品系正常发育和滋生。。。。。。这些特点以及胰腺病变的功夫线使其成为测试各类环境侵害（酒精、吸烟、高脂饮食）或药物对慢性胰腺炎影响的梦想模型。。。。。。

原文检索：

Human CPA1 mutation causes digestive enzyme misfolding and chronic pancreatitis in mice

Gut 2018;0:1–12. doi:10.1136/gutjnl-2018-315994