?Click EdU-555细胞增殖检测试剂盒

货号：ZK-PL4014

描述：

EdU（5-Ethynyl-2'- deoxyuridine，，，，，，，5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷）是一种含有一个乙炔基团的胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，，，，，，，当将其注射到动物体内或者对体表造就的细胞进行孵育，，，，，，，这些幼分子可能迅速扩散到各个器官组织，，，，，，，并渗入到细胞中，，，，，，，能够在细胞增殖时期包办胸苷（T）掺入到新合成的 DNA 中。。。。。。。。EdU分子中的乙炔基团能与荧光象征的叠氮化合物探针在铜离子催化下产生“点击”反映形成不变的三唑环，，，，，，，因而能够使新合成的 DNA 被相应的荧光探针所象征。。。。。。。。EdU 检测法同放射性象征核苷掺入法相比，，，，，，，没有放射性传染等限度成分；；；；；；；同 BrdU 检测法相比，，，，，，，EdU 检测法不必要 DNA 的变性处置，，，，，，，也不用抗原抗体反映，，，，，，，这大大削减了尝试的复杂性和功夫，，，，，，，也使其变得更省时、更活络、更不变和更正确。。。。。。。。本试剂盒可用于检测体表造就的细胞或动物组织中细胞增殖情况。。。。。。。。本试剂盒中荧光探针为红色荧光，，，，，，，最大引发波长为 557nm，，，，，，，最大发射波长为 570 nm，，，，，，，处于增殖的细胞被象征后，，，，，，，细胞核会显示出明红色荧光，，，，，，，通过配套通例细胞核染料共同象征细胞核（本试剂盒提供 Hoechst 33342 细胞核染料），，，，，，，可用荧鲜明微镜、激光共聚焦显微镜等仪器直接观察细胞增殖情况；；；；；；；也能够使用流式细胞仪检测体表造就细胞群荧光强度，，，，，，，凭据荧光强度，，，，，，，来判断细胞周期中 S 期的 DNA 复造活性。。。。。。。。

贮存与运输
冰袋（wet ice）运输；；；；；；；-20℃避光保留，，，，，，，EdU催化试剂(试剂 A)及反映缓冲液可4℃保留；；；；；；；有效期12个月。。。。。。。。

组成：100次
EdU 贮存液（10 mM）：100μL
试剂 A（催化试剂）：120μL
试剂 B（荧光染料 iF555）：50μL
试剂 C（催化增长剂）：2×100mg（powder）
反映缓冲液：20mL
Hoechst33342染色液：30μL

操作步骤

1.体表细胞样品以及试剂筹备工作：

1.1.将细胞按肯定密度均匀种植于细胞造就板中（种植密度，，，，，，，由细胞大幼、成长快慢等成分决定），，，，，，，待细胞贴壁或复原正常状态后，，，，，，，进行相应的药物刺激等处置（如检测悬浮细胞，，，，，，，请按悬浮细胞通例操作方式进行，，，，，，，整体尝试均需增长离心等步骤）
1.2. 试剂C（催化增长剂）低速离心，，，，，，，参与1mL超纯水溶化，，，，，，，并分装后于-20℃存放备用
2. 体表细胞 EdU 象征、固定及通透：
2.1.配造 2×EdU孵育工作液：每1mL 齐全细胞造就基中参与2μL EdU 存储液（10 mM），，，，，，，即为 20μM 的 2×EdU 孵育工作液，，，，，，，并放入造就箱中预热（建议预尝试以 EdU 工作浓度为 10 μM 进行摸索）
2.2.以半换液的模式，，，，，，，将造就板中原细胞造就基吸除一半，，，，，，，并补加等体积预热的 2×EdU 孵育工作液，，，，，，，
孵育肯定的功夫（孵育的功夫通常取决于对应的细胞成长周期，，，，，，，通常占细胞周期 10%左右的功夫。。。。。。。。对于大败京普利莱基因技术有限公司 电话 010-62053186, 62027915 Email：多贴壁且成长较快的细胞，，，，，，，建议孵育 2 h 左右。。。。。。。。具体情况，，，，，，，必要随细胞个性、处置后现实情况等进行调整。。。。。。。。如需孵育较长功夫可适当降低 EdU 工作浓度；；；；；；；较短功夫则可适当提高 EdU 浓度）
2.3.将EdU象征孵育后的细胞样品，，，，，，，用PBS缓冲液洗濯1-2次后，，，，，，，参与固定液，，，，，，，覆盖细胞即可，，，，，，，室温固定15min（如需用流式检测，，，，，，，贴壁细胞此步之前先消化沉悬后再固定，，，，，，，后续按悬浮细胞的处置方式即可）；；；；；；；用 PBS 缓冲液洗涤 2-3 次，，，，，，，每次 3-5 min；；；；；；；
2.4.去除PBS缓冲液，，，，，，，参与通透液，，，，，，，覆盖细胞或组织即可，，，，，，，室温孵育 15 min；；；；；；；
2.5. 去除通透液后使用 PBS 缓冲液洗涤 1-2 次，，，，，，，每次 3-5 min，，，，，，，而后转至步骤 4。。。。。。。。3. 动物 EdU 注射造模以及组织切片处置：
3.1. 凭据尝试要求，，，，，，，以腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、尾静脉注射等方式对动物进行一次或屡次 EdU注射造模，，，，，，，通常尝试 EdU 用量和动物体沉的比值为 5 mg/kg，，，，，，，具体注射量凭据钻研内容和动物情况而定。。。。。。。。本试剂盒中提供部门 EdU 贮存液，，，，，，，重要用于体表细胞 EdU 象征，，，，，，，如需对动物进行 EdU 造模，，，，，，，可单独订购 EdU试剂；；；；；；；
3.2. 幼肠等上皮组织细胞增殖速度快，，，，，，，大脑等组织细胞增殖速度慢，，，，，，，成长较快的组织部位通常象征功夫幼于 12 幼时，，，，，，，而成长较慢的组织象征功夫可能需几天；；；；；；；最佳象征功夫凭据具体尝试而定，，，，，，，由于幼肠上皮组织增殖较快，，，，，，，建议取该类组织作为象征参考；；；；；；；
3.3. 将造模动物依照划定尺度正法后，，，，，，，取出所需的组织，，，，，，，依照通例步骤造作冰冻切片或石蜡切片；；；；；；；
a. 对于冰冻切片：搁置复原到室温，，，，，，，参与适量固定液，，，，，，，室温固定 15 min。。。。。。。。去除固定液，，，，，，，用适量 PBS 缓冲液洗涤 3 次，，，，，，，每次 3-5 min；；；；；；；去除 PBS 缓冲液，，，，，，，用适量通透液覆盖组织室温孵育 10-15 min；；；；；；；去除通透液，，，，，，，用 PBS 缓冲液洗涤 1-2 次，，，，，，，每次 3-5 min，，，，，，，而后转至步骤 4。。。。。。。。
b. 对于石蜡切片：切片脱蜡复水，，，，，，，PBS 洗涤 5 min。。。。。。。。去除 PBS 缓冲液，，，，，，，参与通透液，，，，，，，覆盖细胞或组织即可，，，，，，，室温孵育 15 min；；；；；；；去除通透液后使用 PBS 缓冲液洗涤 1-2 次，，，，，，，每次 3-5 min，，，，，，，而后转至步骤 4。。。。。。。。
4. EdU 点击反映：
4.1. 在细胞或组织固定和穿孔期间，，，，，，，配造点击反映液（对于分歧样本配造系统参考以下表中规划）对于体表造就细胞：本参考步骤是对应 10 个 96 孔板样品的体积用量（每孔 100 μL），，，，，，，可凭据使用需要，，，，，，，等比例增长或削减配造量，，，，，，，请按下表挨次顺次增长组分，，，，，，，边加边混匀（现配现用）；；；；；；；
反映缓冲液 935 μL
试剂 A：催化试剂 10 μL
试剂 B：荧光染料 iF5555 μL
试剂 C：催化增长剂 50 μL
总体积
1000 μL
对于组织细胞切片：参考下系统进行点击反映液系统的配造，，，，，，，可凭据切样本数，，，，，，，等比例增长或减幼配造量，，，，，，，每个切片样本约用 100-200 μL 点击反映液覆盖。。。。。。。。
反映缓冲液 928 μL
试剂 A：催化试剂10 μL
试剂 B：荧光染料 iF555 12 μL
试剂 C：催化增长剂 50 μL
总体积 1000 μL
4.2.去除上一步（步骤2.5或3.3）PBS 缓冲液，，，，，，，参与点击反映液，，，，，，，轻摇保障反映液全数覆盖细胞或组织，，，，，，，室温避光孵育 30 min；；；；；；；
4.3.去除点击反映液，，，，，，，PBS缓冲液洗涤 2-3 次，，，，，，，每次3-5min（如无其他出格要求，，，，，，，即可用流式细胞仪检测其荧光强度或用其他仪器检测荧光成效）。。。。。。。。
5. 细胞核染色：
5.1.去除上一步PBS缓冲液，，，，，，，将 Hoechst 33342染色液与 PBS 缓冲液以1比500-1000比例稀释后，，，，，，，参与覆盖细胞，，，，，，，孵育 5min；；；；；；；
5.2.去除 Hoechst 33342 染色液，，，，，，，PBS 缓冲液洗涤2-3次，，，，，，，每次3-5min。。。。。。。。
6.成像以及检测分析
直接将体表造就的细胞或者组织切片样品置于荧鲜明微镜或共聚焦显微镜等仪器检测，，，，，，，分析处于增殖的细胞占比；；；；；；；或者网络体表造就的细胞，，，，，，，用流式细胞仪检测荧光强度（建议使用未经 EdU 象征的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照，，，，，，，并选择相宜的电压），，，，，，，凭据荧光强度，，，，，，，来判断细胞周期中 S 期的 DNA 复造活性。。。。。。。。本试剂盒试剂 B：（荧光染料 iF555）对应的光谱个性为 Ex/Em：557 nm/570 nm（红色）；；；；；；；Hoechst 33342染色液对应的光谱个性为 Ex/Em：346 nm/460 nm（蓝色）。。。。。。。。

当苦衷项
1. 对于体表造就细胞，，，，，，，具体 EdU 使用浓度、孵育功夫随样品以及钻研主张的分歧，，，，，，，可进行适当调整。。。。。。。。
2. 部门组织细胞增殖速度缓慢，，，，，，，为了排除造模成效欠安等成分，，，，，，，建议选增殖快的组织样品作为参照样本（如肠路组织）。。。。。。。。
3. 若是布景致彩过深，，，，，，，可能是尝试中洗涤不充分、组织样品固按功夫过长、固定液残存导致。。。。。。。。
4. 试剂C：（EdU 催化增长试剂）易氧化，，，，，，，尽量预防长功夫露出于空气中，，，，，，，配造成水溶液后，，，，，，，建议分装保留；；；；；；；经测试，，，，，，，如 EdU 催化增长试剂色彩产生轻微变动，，，，，，，点击反映催化系统仍旧可能正常进行，，，，，，，如出现棕色，，，，，，，批注该组分已失效，，，，，，，请弃用。。。。。。。。
5. 操作时请穿尝试服，，，，，，，佩带一次性手套。。。。。。。。